液相色譜柱-柱效測(cè)試DEMO指南：為什么我測(cè)的柱效就是沒(méi)有COA報(bào)告高？

一、 DEMO說(shuō)明

在色譜柱柱效測(cè)試時(shí)，有較多因素影響柱效測(cè)試結(jié)果，我們于此特列出各種影響及注意事項(xiàng)。

二、 柱效測(cè)試影響因素

1.系統(tǒng)擴(kuò)散體積

定義：系統(tǒng)擴(kuò)散體積影響色譜柱性能，包括進(jìn)樣器到流通池的體積。 儀器系統(tǒng)擴(kuò)散體積是指對(duì)色譜柱性能有很大影響，尤其是小顆粒色譜柱。

擴(kuò)散體積來(lái)源組成：

圖1

儀器本身死體積具體影響：

2.1*50mm 1.6μm CORTES C18 乙腈/水=70:30（v/v）

0.4ml/min 0.5ul 丙酮，苯，二氫苊

結(jié)論：死體積增加會(huì)降低柱效、會(huì)發(fā)生額外擴(kuò)散、柱效降低。小內(nèi)徑色譜柱（2.1mm）或體積較小的色譜柱受柱外體積影響，對(duì)柱效的影響更大。

案例1:

色譜柱：

Waters ACQUlTY UPLC BEH C18, 1.7 µm, 2.1 mm X 50 mm (PN 186002350）測(cè)試二氫苊

產(chǎn)品詳情請(qǐng)點(diǎn)擊：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱 186002350

附：測(cè)試系統(tǒng)擴(kuò)散體積的方法：

用二通代替色譜柱，連接管路后，按照如下方法測(cè)試系統(tǒng)擴(kuò)散體積。

系統(tǒng)擴(kuò)散體積計(jì)算公式：

擴(kuò)散體積位μL=4.4% 峰高處的三次平均峰寬（min）×流速（mL/min）×1000

計(jì)算示例：

2. 流動(dòng)相對(duì)柱效測(cè)試結(jié)果的影響

流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的比例對(duì)峰高、 峰面積以及柱效均可能有影響。

案例2:

色譜柱：Waters BEH C18 1.7um 2.1×50mm (PN 186002350 ）測(cè)試結(jié)果（流速：0.35ml/min)

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3. 不同柱效測(cè)試液

不同廠家，不同類(lèi)型的色譜柱其柱效測(cè)試的化合物各不相同，如反相色譜柱可選苯、荼、苊等各種類(lèi)型的檢測(cè)方法，盡量采用與廠家相同的化合物測(cè)試。

Waters XBridge BEH C18 1.7μm 2.1x50mm 測(cè)試不同化合物的結(jié)果：

產(chǎn)品詳情請(qǐng)點(diǎn)擊：Waters XBridge BEH C18色譜柱 186003117

Xterra C18 5.0μm 4.6×250mm測(cè)試不同化合物的結(jié)果：

產(chǎn)品詳情請(qǐng)點(diǎn)擊：Waters XTerra MS C18 色譜柱 186000494

4．不同柱內(nèi)徑的影響：

死體積對(duì)不同柱內(nèi)徑大小有不同影響 寬內(nèi)徑影響較小，窄內(nèi)徑影響較大。

案例3:

三、正確的柱效測(cè)試演示實(shí)驗(yàn)

1.    COA報(bào)告

                              圖8

2. 儀器

高效液相色譜儀，需配備合適的檢測(cè)器（如紫外－可見(jiàn)檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等）、進(jìn)樣器和色譜柱恒溫箱。

注：關(guān)注儀器的死體積情況，盡量選擇死體積小的連接管路和檢測(cè)器流通池，尤其是在使用小規(guī)格色譜柱時(shí)。

四、 操作步驟

若儀器系統(tǒng)之前使用過(guò)高鹽體系，建議先用純水沖洗5-10min后， 再接如下步驟操作：

a)    儀器接兩通，待用管路放置新鮮有機(jī)相（乙腈或甲醇），灌注5min后先用有機(jī)相（乙腈或甲醇）沖洗系統(tǒng)約5min 。

b)    將色譜柱連接至系統(tǒng)上，以0.1ml/min開(kāi)始緩慢增加流速至0.8 mL/min，小粒徑色譜柱可降低流速。用有機(jī)相（乙腈或甲醇）沖洗色譜柱，約20 min。

c)    更換柱效測(cè)試流動(dòng)相， 緩慢調(diào)節(jié)流速至測(cè)定流速，平衡色譜柱，一般需5-10倍柱體積，直至壓力和基線穩(wěn)定。 在平衡過(guò)程中，密切關(guān)注壓力變化，若壓力異常波動(dòng)，可能存在堵塞或泄漏等問(wèn)題，需及時(shí)排查。

d)    準(zhǔn)確吸取適量測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品，為保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄下每次測(cè)試數(shù)據(jù)。

e)    根據(jù)測(cè)得理論塔板數(shù)結(jié)果計(jì)算柱效，EP和USP理論塔板數(shù)有區(qū)別。

五、 注意事項(xiàng)

若測(cè)試結(jié)果柱效明顯偏低、 峰形拖尾、 柱壓較高，需全面排查問(wèn)題。

a） 檢查色譜柱是否污染， 可通過(guò)沖洗色譜柱或更換保護(hù)柱進(jìn)行驗(yàn)證。

b） 確認(rèn)流動(dòng)相比例是否準(zhǔn)確。

c）  檢查儀器系統(tǒng)，包括連接管路是否有泄漏、 堵塞， 檢測(cè)器是否正常工作等， 同時(shí)考慮死體積是否過(guò)大對(duì)柱效產(chǎn)生了不良影響。

若對(duì)相關(guān)內(nèi)容還有任何疑問(wèn)或者難題，請(qǐng)聯(lián)系Waters授權(quán)代理商——廣州綠百草。